아가로스겔 마이크로캡슐로 간편하게

Scientific Reports 12권, 기사 번호: 17014(2022) 이 기사 인용

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고품질의 단일 세포 증폭된 박테리아 게놈 DNA를 얻기 위해 알지네이트 피콜리터 졸 코어와 아가로스 겔 쉘로 구성된 새로운 유형의 아가로스 겔 마이크로캡슐(AGM)이 개발되었습니다. AGM은 표준 실험실 장비만으로 AGM 응집을 방지하는 물과 동등한 밀도의 오일을 함유한 안정적인 에멀젼으로 쉽게 준비할 수 있습니다. 인간 장내 세균 15종으로 구성된 모의 집단인 대장균의 순수 배양물과 흰개미 장내 세균 집단의 단일 세포를 AGM 내에 캡슐화하고, 이들의 게놈 DNA 샘플을 튜브에서 대규모 병렬 증폭으로 준비했습니다. 게놈 시퀀싱은 2차 증폭이 필요하지 않았으며 게놈 구아닌-시토신 함량에 관계없이 마이크로리터 규모의 기존 증폭 방법을 사용하여 얻은 것보다 훨씬 더 높은 평균 게놈 완전성을 보여주었습니다. AGM을 활용한 우리의 새로운 방법을 통해 많은 연구자들이 단세포 유전체학을 쉽고 효과적으로 수행할 수 있으며, 아직 배양되지 않은 미생물의 유전체 분석을 가속화할 수 있습니다.

미생물은 다양한 환경에 어디에나 분포되어 있습니다. 그들은 종종 다른 유기체와 연관되어 있으며 생태계에서 중요한 역할을 합니다. 그러나 대부분의 미생물종은 기존의 방법으로는 배양이 어려워 아직 배양되지 않은 미생물이라 불린다1. 지난 20년 동안 SSU rRNA(Small Subunit Ribosomal RNA) 유전자의 앰플리콘 시퀀싱 분석 및 메타게놈의 샷건 시퀀싱 분석과 같은 배양 독립적인 방법을 사용하여 광범위하게 연구되었습니다. Metagenomics는 암호화된 유전적 레퍼토리를 기반으로 미생물총의 생태학적, 생리학적 기능을 조사하기 위한 강력한 도구입니다. 최근 메타게놈 조각을 각각의 미생물 분류학적 어셈블리로 계산하는 비닝의 개발로 인해 메타게놈학의 유용성이 강화되었습니다2,3. 그러나 서열 구성, 데이터베이스 서열과의 상동성 및 각 단편의 서열 판독 범위를 기반으로 한 전산 비닝은 밀접하게 관련된 (하위)종의 게놈을 구별하고 rRNA와 같은 다른 특징과 구별되는 특징을 나타내는 게놈 영역을 올바르게 정렬하지 못하는 경우가 많습니다. 유전자, 프로파지 및 플라스미드4,5. 또한, 미생물 군집에서 소수 종의 게놈 서열을 얻으려면 대규모 시퀀싱 노력이 필요합니다3.

전체 게놈 DNA가 물리적으로 분리된 단일 세포에서 증폭되는 단일 세포 게놈학은 아직 배양되지 않은 미생물의 대사 능력을 밝히기 위한 대체 또는 보완 방법으로 사용되어 왔습니다1,7. 단일 세포 분리는 FACS(형광 활성화 세포 분류)1, 미세 조작기8, 미세 유체 장치9,10 및 유중수 방울11의 캡슐화와 같은 기술을 사용하여 많은 경우에 달성될 수 있습니다. 전체 게놈 증폭을 위한 다양한 방법이 개발되었지만12, 무작위 프라이머와 함께 phi29 DNA 중합효소를 사용하는 다중 치환 증폭(MDA)은 상대적 단순성, 신뢰성 및 적용성으로 인해 가장 널리 사용됩니다6,13. 그러나 MDA는 본질적으로 단일 세포 유전체학의 주요 기술적 한계였던 게놈 영역 간의 극심한 증폭 편향을 보여줍니다. 또한 게놈 DNA의 높은 구아닌-시토신(GC) 함량은 증폭 편향을 증가시키는 경향이 있습니다1,14. 작은 반응 용기를 사용하면 증폭 바이어스를 억제할 수 있습니다. 예를 들어, 마이크로채널 챔버(60nL)10, 나노리터 마이크로웰(12nL)15, 가상 미세유체공학(겔 시트의 MDA, 60nL)16, 마이크로채널(9.5-240pL)을 사용하여 생성된 디지털 액적17,18, 19 및 겔 비드20. 그러나 이러한 미세 가공 기술은 많은 미생물학자가 사용할 수 없으며 증폭 산물의 양은 직접적인 게놈 서열 분석에 너무 적은 경우가 많습니다. 따라서 MDA의 두 번째 라운드가 필요한 경우가 많으며 이는 궁극적으로 증폭 바이어스를 향상시킵니다.

1 kb were used for the subsequent analyses. Several factors describing the genome sequence quality, including completeness and contamination rate, were evaluated using CheckM29 and QUAST30 and compared between the SAGs obtained using MDA-in-AGM and FACS-MDA./p> 5% of the mock community with the exception of Faecalibacterium prausnitzii (Supplementary Table S4). For example, SAGs of Bacteroides thetaiotaomicron and Parabacteroides distasonis exhibited clear differences between MDA-in-AGM and FACS-MDA in genome completeness, number of contigs, and amplification bias, as seen in the E. coli SAGs (Fig. 3, Supplementary Fig. S5). Since many SAGs obtained from environmental samples were difficult to compare at the same coverage due to lack of their reference genomes, the mock SAGs were assembled using 0.3 M read pairs in the following experiments. The overall genome completeness of SAGs with < 5% contamination was significantly higher in MDA-in-AGM (68.0% ± 23.3%, n = 39) than in FACS-MDA (42.4% ± 20.5%, n = 36) (P < 0.01) (Supplementary Tables S5, S6). The SAGs of most other strains also showed similar results to the E. coli SAGs (Supplementary Fig. S6)./p> 5% contamination, which would be caused either by contaminating extracellular DNA or by multiple cells being encapsulated in a single AGM, were binned into each bacterial species using metaWRAP31, although discrimination between contaminating DNA and DNA from captured multiple cells was difficult. As a result, 30 additional SAGs with < 5% contamination were obtained, and their genome completeness and contamination rates were 73.5% (median) and 0.9% (median), respectively (Supplementary Table S8)./p>

1 kb contigs were selected using the SeqKit (https://bioinf.shenwei.me/seqkit/) for the subsequent analyses./p> 5% contamination, identified using CheckM29, were sequentially subjected to binning, refinement, and reassembly processes with the BINNING (including metaBAT259, MaxBin260 and CONCOCT61), BIN_REFINEMENT, and REASSEMBLE_BINS modules of metaWRAP31./p>

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