치료적 응용을 위한 단분산 원형질막 유래 세포밖 소포체의 고효율 제조

커뮤니케이션 생물학 6권, 기사 번호: 478(2023) 이 기사 인용

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세포외 소포(EV)는 차세대 치료제 설계에 매우 흥미롭습니다. 그러나 이들의 준비 방법은 표준화, 수율 및 재현성 측면에서 어려움에 직면해 있습니다. 여기에서는 기존 EV 준비 방법보다 세포당 및 시간당 10~100배 더 많은 입자를 생성하는 단분산 나노 원형질막 소포(nPMV)를 위한 매우 효율적이고 재현 가능한 EV 준비 방법을 설명합니다. nPMV는 화학적 스트레스 요인에 의해 유도된 세포막 수포 및 세포사멸 신체 분비 후 거대 원형질막 소포를 균질화하여 생성됩니다. nPMV는 저온 TEM 분석, 시험관 내 세포 상호 작용 및 제브라피시 유충의 생체 내 생체 분포 연구에서 동일한 세포주의 기본 EV와 비교하여 유의미한 차이를 나타내지 않았습니다. 반면, Proteomics와 Lipidomics는 이 두 가지 EV 유형의 다양한 기원과 일치하는 실질적인 차이를 제시하고 nPMV가 주로 세포사멸 세포외 소포에서 유래함을 나타냅니다. nPMV는 EV 기반 제약 치료제 개발을 위한 매력적인 소스를 제공할 수 있습니다.

세포외 소포(EV)는 세포 유래 막성 소포로, 세포 특이적 지질, 단백질(예: 효소, 세포 부착 분자, 분화 단백질 클러스터(CD)), 핵산(예: 다양한 RNA 및 DNA), 대사산물을 운반합니다. , 소기관, 때로는 바이러스1,2. EV는 생물 발생에 따라 엑소솜과 엑토솜이라는 두 가지 주요 범주로 분류됩니다2. 엑소좀은 작은 EV(직경 40-150 nm)이며 세포의 엔도솜 구획에서 유래하며 다포체 또는 양서류2,3,4의 세포외유출을 통해 원핵 및 진핵 세포에 의해 주변으로 지속적으로 방출됩니다. 반면에 엑토솜은 원형질막의 직접적인 발아/수포에 의해 형성되며 미세소포, 세포사멸체(ApoBD), 세포사멸 세포외 소포(ApoEV) 및 대형 온코솜을 포함한 다양한 유형의 소포로 구성된 큰 그룹으로 구성됩니다. 엑토솜은 50 nm에서 1000 nm2,5,6에 이르는 매우 다양한 크기를 가지고 있습니다. 단백질체학 및 지질체학 분석 결과를 바탕으로 EV는 기증자(전조) 세포로부터 유전된 정의된 분자 지문을 갖는 것으로 나타났습니다. 살아있는 유기체에서 그들은 기원에서 멀리 떨어진 세포와 상호 작용하고, 내부화되어 내용을 방출하고, 신호 이벤트의 변경을 포함한 표현형 변화를 유도할 수 있습니다2,9,10. 세포 및 동물 모델의 약물 전달 목적으로 EV에 치료용 핵산, 단백질 또는 저분자량 약물을 적재하기 위한 다양한 전략이 제안되었습니다. 치료 적용 분야의 대부분의 EV 연구는 아직 전임상 단계에 있지만 소규모 세트는 인간 임상 시험으로 진행되고 있습니다12,13. EV(특히 엑소좀) 기반 기술에 대한 큰 관심에도 불구하고 진행 속도가 느려졌을 뿐만 아니라 부분적으로 대규모 생산 문제로 인해 진행이 느려졌습니다. 일반적인 EV 분비율은 60-170 입자/세포/h만큼 적으며 생산은 사용되는 세포 유형에 따라 크게 달라집니다. 따라서 대량의 EV를 제조하려면 상당한 양의 기증자 셀이 필요하고 시간이 많이 걸립니다. 또한 생산된 EV의 분리, 정제 및 하위 분류가 프로세스를 방해하고 있습니다. 상황은 개별 실험실에서 사용하는 프로토콜과 실험 조건 간의 차이로 인해 더욱 복잡해집니다. 따라서 EV 학회에서는 전임상 연구를 가속화하고 궁극적으로 EV 기반 치료제의 임상 번역을 가속화하기 위해 생산 및 특성화 방법의 표준화에 대한 지침을 개발하고 있습니다12,17. EV의 수율을 높이기 위한 여러 가지 접근법이 연구되었습니다. 전체 세포의 기계적 압출 또는 전단 응력은 기본 EV와 유사한 물리화학적 및 생물학적 특성을 가진 EV 유사 나노소포의 더 높은 수율을 생성했습니다. 또한, 기증자 세포의 스트레스는 다양한 모델에서 EV 분비를 실질적으로 증가시켰습니다. 표준 실험실 EV 준비 프로토콜의 한계로 인해 본 연구의 목표는 재현성이 높은 단분산 EV를 준비하는 효율적인 방법을 개발하는 것입니다. 거대 원형질막 소포(GPMV)는 화학적 스트레스 요인에 의해 유발된 세포 사멸과 그에 따른 막 수포화에 의해 생성되었습니다. GPMV는 EV 생산을 위한 출발 물질(그림 1)로 사용하기 위해 탐색되었습니다. 그 후, 나노 원형질막 소포(nPMV)를 생성하는 압출에 의해 GPMV의 크기가 감소되었습니다. 그런 다음 nPMV를 동일한 기증자 세포주에서 분리된 기본 EV와 나란히 특성화하여 생산 수율 및 속도, 물리화학적 특성, 2D 및 3D 형태(극저온 투과 전자 현미경, 극저온 TEM 사용), 분자 구성을 비교했습니다. (단백질체학 및 지질체학), 척추동물 약동학 모델로서 형질전환(Tg) 제브라피시 유충(ZFL)을 사용한 생체외 세포 상호작용 및 생체내 생체분포.